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NCB：薛愿超團隊等開發新技術，首次在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RBP結合位點


NCB：薛愿超團隊等開發新技術，首次在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RBP結合位點
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人類基因組編碼了約1500個RNA結合蛋白（RNA-binding protein, RBP） ， 它們往往通過結合RNA分子上的特定基序或結構元件而調控細胞內各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩定性等 。 RBP在早期生殖、個體發育、細胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過程中都發揮了關鍵的調控作用 。 RNA結合蛋白的突變會導致多種遺傳性疾病 。 比如 ， FUS和TDP43的突變可導致肌肉萎縮性側索硬化癥 ， 而U2AF35、SF3B1等的突變會導致骨髓增生異常綜合癥的發生 。 準確鑒定RBP的結合靶標及精確結合位置是理解其生理和病理調控機制的前提 。
目前常用的鑒定RBP靶標的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq 。 由于這兩種方法都依賴于利用特異性抗體富集RBP及其所結合的RNA ， 而且需要百萬數量級的細胞 ， 因此嚴重限制了這些方法在稀有細胞類型及臨床穿刺樣本中的應用 。 比如 ， RBP在早期生殖和胚胎發育過程中發揮著關鍵調控作用 ， 但是由于缺乏可在微量細胞甚至單細胞水平研究RBP靶標的實驗方法 ， 導致早期生殖過程中RBP及其復合物的分子機制研究依然是個空白 。
2021年6月9日9 ， 中國科學院生物物理研究所薛愿超研究員 ， 及廣東省第二人民醫院孫青原教授、北京大學黃超蘭教授作為共同通訊作者 ， 在 Nature Cell Biology 期刊發表了題為：Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq 的技術報告論文 。
研究團隊開發了可在微量細胞中鑒定RBP作用靶點的新技術LACE-seq（Linear amplification of cDNA ends and sequencing） 。 通過線性擴增逆轉錄酶在RBP結合位點處的終止信號 ， 首次實現了在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RBP的結合位點 ， 為研究RBP在胚胎發育和生殖疾病中的功能機制打開了大門 。

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利用創建的LACE-seq方法 ， 研究團隊取得如下研究成果：
1）首次在卵細胞中繪制了Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RBP的具體靶標和結合位置；
2）率先發現Ago2/endo-siRNA沉默復合物在卵細胞中以非完全互補配對的方式抑制mRNA的翻譯 ， 并證明endo-siRNA的靶標Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關；
3）證明了Ago2/endo-siRNA復合物可切割由逆轉座子（Long-terminal repeat retrotransposons）啟動子起始的嵌合體RNA ， 該機制確保了卵細胞中轉錄組的完整性 。

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LACE-seq方法可在微量細胞中準確鑒定PTBP1的結合靶標
據悉 ， 中科院生物物理所博士研究生蘇瑞寶、生物物理所副研究員曹唱唱、動物所博士研究生樊立華為論文共同第一作者；生物物理所薛愿超研究員、動物所及廣東省第二人民醫院孫青原教授、北京大學及北大-清華生命科學聯合中心黃超蘭教授為論文共同通訊作者 。 該項工作得到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金委和中科院先導項目等多項基金資助 。
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