科研 | mSphere：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個(gè)體間相互作用的研究( 三 )
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圖5 預(yù)先建立的微生物群對(duì)艱難梭菌的生長(zhǎng)有抑制作用 。 （A）將在引入艱難梭菌前24小時(shí)建立的微生物群生物膜（9種微生物群1艱難梭菌24小時(shí)延遲）與在相同時(shí)間內(nèi)僅生長(zhǎng)艱難梭菌的生物膜進(jìn)行比較 。 艱難梭菌數(shù)量用PMA-qPCR定量 。 （B）將預(yù)先建立的微生物群（9種微生物群1艱難梭菌：延遲24小時(shí)）對(duì)艱難梭菌的抑制作用與從一開始就與微生物群共培養(yǎng)的艱難梭菌的抑制作用（9種微生物群1艱難梭菌：無延遲）進(jìn)行比較 。 所示數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 。 非配對(duì)t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)顯著性差異 。 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05 。
【科研 | mSphere：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個(gè)體間相互作用的研究】
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圖6 艱難梭菌對(duì)預(yù)先建立的微生物群落的影響 。 PMA-qPCR用于跟蹤添加艱難梭菌前24小時(shí)建立的9種代表性微生物生物膜中單個(gè)物種的細(xì)菌總數(shù) 。 所示數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 。 未配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)用于確定顯著性差異 。 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05 。5 擬桿菌與艱難梭菌個(gè)體相互作用的研究作者想進(jìn)一步研究隨著艱難梭菌抑制而增加的物種是否能夠影響艱難梭菌的生長(zhǎng) 。 以前曾報(bào)道 ， 類桿菌作為混合生物膜培養(yǎng)時(shí) ， 在艱難梭菌存在下繁殖更多 。 作者最近在體外系統(tǒng)中研究了多雷雙歧桿菌（一種豐富的共生體）和艱難梭菌在上皮細(xì)胞層存在下的共培養(yǎng) ， 并證明多雷雙歧桿菌在艱難梭菌存在下繁殖更好 ， 同時(shí)減少艱難梭菌的生長(zhǎng) 。 因此 ， 作者在雙重培養(yǎng)生物膜中研究了多雷雙歧桿菌與艱難梭菌共培養(yǎng)時(shí)的抑制作用 。 在測(cè)定生物膜的CFU計(jì)數(shù)后 ， 將兩個(gè)物種的單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物培養(yǎng)24小時(shí) 。 在共培養(yǎng)中 ， 作者發(fā)現(xiàn)與單一培養(yǎng)對(duì)照相比 ， 多雷雙歧桿菌的存在顯著減少了艱難梭菌的數(shù)量（超過10倍）（圖7） 。 相比之下 ， 當(dāng)與難辨梭狀芽胞桿菌一起培養(yǎng)時(shí) ， 多雷芽胞桿菌的生長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí) 。 艱難梭菌數(shù)量的減少表明多雷桿菌介導(dǎo)的抑制作用 。 為了確保初始生物膜接種沒有偏差 ， 作者測(cè)量了每個(gè)物種的CFU值；艱難梭菌和多雷梭菌之間沒有觀察到顯著差異 。 有趣的是 ， 在這兩個(gè)物種的浮游培養(yǎng)中沒有觀察到類似的細(xì)菌數(shù)量減少 ， 這表明觀察到的抑制作用需要兩個(gè)生物體之間的接觸或物理接近 。 數(shù)據(jù)表明 ， 多雷雙歧桿菌 ， 一種共生類桿菌 ， 在復(fù)雜的群落中隨著艱難梭菌的增加而增加 ， 會(huì)對(duì)艱難梭菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響 。
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圖7 生物膜內(nèi)多雷菌與艱難梭菌的相互作用 。 顯示了生長(zhǎng)24小時(shí)的多雷雙歧桿菌和艱難梭菌的單一或混合生物膜培養(yǎng)物的CFU計(jì)數(shù) 。 所示數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 ， 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差 。 顯著性差異采用非配對(duì)t檢驗(yàn) 。 ***, P < 0.001 。討論
研究腸道微生物群成員之間的分子相互作用對(duì)于了解腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和定植抗性等重要現(xiàn)象非常重要 。 作者首次建立了一個(gè)復(fù)雜的混合生物膜群落 ， 由九個(gè)具有代表性的腸道共生物種組成 。 在這里報(bào)告了一個(gè)基于PCR的方法來調(diào)查這個(gè)復(fù)雜群體中的個(gè)體相互作用 。 定量測(cè)定了不同時(shí)期細(xì)菌數(shù)量的變化 ， 并研究了腸道病原體艱難梭菌對(duì)該群落的影響 。 結(jié)果證明了幾種艱難梭菌在數(shù)量上的變化 ， 包括類桿菌屬 。 進(jìn)一步證明了類桿菌屬中的一種 ， B.dorei ， 可以減少艱難梭菌在雙種生物膜中的生長(zhǎng) 。 目前 ， 用于追蹤腸道內(nèi)物種間相互作用的主要技術(shù)是基因組學(xué)和宏基因組學(xué) 。 基因組測(cè)序提供了很好的洞察什么是目前 ， 但沒有提供短期動(dòng)態(tài)和潛在的細(xì)菌相互作用的信息 。 作者選擇使用還原論的方法 ， 將少量具有代表性的腸道物種進(jìn)行共培養(yǎng) ， 以便更容易獲得輸出數(shù)據(jù) ， 提高可以測(cè)量單個(gè)物種變化的分辨率 。 事實(shí)上 ， 作者還沒有涵蓋所有的關(guān)鍵物種 ， 但鑒于作者選擇的量化技術(shù) ， 現(xiàn)在有可能擴(kuò)大這一種群 ， 以包括更多的物種 。 測(cè)序的主要缺點(diǎn)是它的費(fèi)用 ， 因此 ， 它通常用于分析包含數(shù)百個(gè)物種的復(fù)雜樣品 。 與標(biāo)準(zhǔn)qPCR一樣 ， 基因組測(cè)序并不能消除“死亡”DNA的定量 ， 而“死亡”DNA是準(zhǔn)確定量活細(xì)菌數(shù)量的關(guān)鍵 。 另一種替代PMA-qPCR的方法是熒光原位雜交（FISH） 。 FISH的幾種變體已被用于定量群落內(nèi)的細(xì)菌；然而 ， 基于qPCR的定量通常被認(rèn)為比FISH方法更敏感、更快速、更省力 。 事實(shí)上 ， FISH作為一種補(bǔ)充分析 ， 將增加群落的關(guān)鍵空間細(xì)節(jié) 。 因此 ， PMA-qPCR方法是一種簡(jiǎn)單可靠的方法來量化復(fù)雜群落中個(gè)體成員的變化 。 作者能夠在72小時(shí)內(nèi)成功地追蹤九種混合生物膜中的所有物種 。 有趣的是 ， 在實(shí)驗(yàn)過程中 ， 沒有一種物種占優(yōu)勢(shì)；這表明物種之間更可能發(fā)生交叉取食 ， 而不是直接競(jìng)爭(zhēng) 。 作者認(rèn)為 ， 到72小時(shí) ， 這種生物膜作為一個(gè)整體并不穩(wěn)定 ， 所有物種的細(xì)菌數(shù)量都有所下降 。 即使是在最初48小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出積極生長(zhǎng)跡象的物種（如卵形雙歧桿菌和青春期雙歧桿菌[圖2]）也是如此 ， 這種下降可能是由于廢培養(yǎng)基變得有毒和/或生長(zhǎng)受限 。 實(shí)際上 ， 靜態(tài)生物膜培養(yǎng)模式的一個(gè)缺點(diǎn)是缺乏持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和有毒副產(chǎn)物的去除 。 然而 ， 這樣的生物膜模型更容易建立 ， 并在較短的時(shí)間內(nèi)提供有用的信息 。 在流動(dòng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)展這種多細(xì)菌生物膜 ， 使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在厭氧條件下持續(xù)流動(dòng) ， 將使監(jiān)測(cè)反應(yīng)的時(shí)間更長(zhǎng) 。 在一個(gè)共生群落中加入一種病原體 ， 可望引起對(duì)它的反應(yīng) 。 為了調(diào)查這一點(diǎn) ， 研究反應(yīng)腸道病原體艱難梭菌介紹 。 艱難梭菌是一種機(jī)會(huì)性腸道病原體 ， 引起艱難梭菌感染（CDI） ， 是美國醫(yī)院相關(guān)性腹瀉的主要原因 ， 每年新增50萬例 ， 重復(fù)感染率為1/5 。 對(duì)艱難梭菌定植的最好防御是健康的腸道微生物群 ， 它提供對(duì)疾病的自然免疫 。 抗生素與它們所針對(duì)的病原體一起對(duì)腸道微生物群產(chǎn)生負(fù)面影響 ， 導(dǎo)致腸道微生物群的改變和CDI的可能性增加 。 腸道微生物群的明顯變化與CDI有關(guān)；然而 ， 由于大多數(shù)數(shù)據(jù)來自糞便樣本的測(cè)序 ， 因此缺乏關(guān)于粘膜相關(guān)種群和定植早期變化的信息 。 有趣的是 ， 艱難梭菌的存在導(dǎo)致了共生群落中許多微生物物種的粘附增加（圖3A） 。 作者預(yù)測(cè)艱難梭菌可能產(chǎn)生一種代謝副產(chǎn)物 ， 改善微生物群中物種的初始生長(zhǎng)和結(jié)合 ， 或者艱難梭菌產(chǎn)生的信號(hào)分子被微生物群檢測(cè)到并誘導(dǎo)這些物種內(nèi)的代謝變化 。 有必要使用艱難梭菌進(jìn)行進(jìn)一步研究 ， 以確定可溶性因子是否參與觀察到的粘附增加 ， 或者這是否是一種代謝效應(yīng) 。 當(dāng)艱難梭菌與微生物群（圖3B）一起培養(yǎng)時(shí)觀察到的初始粘附的減少是預(yù)期的 ， 因?yàn)橛写罅筷P(guān)于微生物群對(duì)艱難梭菌定植的破壞作用的數(shù)據(jù) 。 粘附性的小幅度降低（約50%）可能是因?yàn)槲⑸锶郝錄]有預(yù)先建立 ， 這通常是感染艱難梭菌的情況 。 膽汁酸和膽汁鹽對(duì)艱難梭菌在腸道的定植能力有相當(dāng)大的影響 ， 微生物群會(huì)轉(zhuǎn)化艱難梭菌萌發(fā)所需的主要膽汁酸 ， 如牛磺膽酸 。 它們轉(zhuǎn)化成的次級(jí)膽汁酸也能抑制艱難梭菌的生長(zhǎng) 。 作者使用的培養(yǎng)基中沒有膽汁酸 ， 這表明觀察到的艱難梭菌抑制不是通過初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸 。 因此 ， 通過次級(jí)膽汁酸的產(chǎn)生來阻止細(xì)菌萌發(fā)似乎只是定植抗性機(jī)制的一部分 。 事實(shí)上 ， 當(dāng)在引入艱難梭菌前24小時(shí)預(yù)先建立微生物生物膜時(shí) ， 作者發(fā)現(xiàn)艱難梭菌的生長(zhǎng)受到很大影響（圖5A和B） 。 預(yù)先建立微生物群可導(dǎo)致共生細(xì)菌的豐度增加 ， 并導(dǎo)致任何分泌的抑制分子水平升高 。 此外 ， 艱難梭菌粘附所需的物理空間將少得多 ， 艱難梭菌所需的任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都可以在這一階段從培養(yǎng)基中取出 。 在一次成功的感染中 ， 艱難梭菌已經(jīng)被報(bào)道通過調(diào)節(jié)細(xì)菌代謝 ， 包括吲哚的產(chǎn)生來控制微生物群 。 它通過影響色氨酸酶（tnaA）在其他物種中的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)；艱難梭菌被認(rèn)為通過吲哚介導(dǎo)的抑制腸道保護(hù)細(xì)菌的生長(zhǎng)來限制微生物群的恢復(fù) 。 當(dāng)艱難梭菌與共生群落共培養(yǎng)時(shí) ， 觀察到多雷雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、大腸桿菌、普氏鐮刀菌的數(shù)量有小而顯著的增加 。 雖然這9個(gè)物種中 ， 卵形芽胞桿菌、θ型芽胞桿菌、青春期芽胞桿菌、大腸桿菌和普氏芽胞桿菌是吲哚產(chǎn)生菌 ， 但沒有發(fā)現(xiàn)抑制作用 。 鑒于艱難梭菌反而受到抑制 ， 有可能細(xì)菌無法達(dá)到足夠的數(shù)量來影響吲哚的產(chǎn)生 。 此外 ， 在預(yù)先建立的群落中加入艱難梭菌后 ， 發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比 ， 大腸桿菌數(shù)量增加（圖6） 。 同樣 ， 在CDI患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)過多的變形桿菌 ， 這是艱難梭菌成功感染的一個(gè)特征 。 然而 ， 平行觀察到的多種擬桿菌數(shù)量的增加可能解釋了在這個(gè)系統(tǒng)中觀察到的艱難梭菌的抑制作用 。 艱難梭菌感染與類桿菌的顯著減少有關(guān) ， 這可能提示腸道內(nèi)這些細(xì)菌具有保護(hù)作用 。 有趣的是 ， 艱難梭菌與多雷類桿菌（一種豐富的腸道共生物種）共培養(yǎng)時(shí) ， 其生長(zhǎng)受到負(fù)面影響（圖7） 。 在脆弱類桿菌存在的情況下 ， 艱難梭菌的生長(zhǎng)量減少 。 值得注意的是 ， 脆弱雙歧桿菌與多雷雙歧桿菌非常相似 ， 與艱難梭菌混合培養(yǎng)的數(shù)量比單獨(dú)培養(yǎng)的數(shù)量多 ， 并且生長(zhǎng)抑制作用對(duì)生物膜生長(zhǎng)具有特異性 ， 這表明細(xì)胞間的相互作用/物理接近可能起到了一定的作用 。 作者最近也報(bào)道了在體外腸道模型中艱難梭菌在上皮細(xì)胞上的生長(zhǎng)在多雷雙歧桿菌的存在下減少 。 最近有報(bào)道稱 ， 脆弱雙歧桿菌通過潛在影響上皮屏障的完整性 ， 在小鼠感染模型中預(yù)防艱難梭菌感染 。 雖然這些數(shù)據(jù)支持類桿菌在預(yù)防艱難梭菌感染方面的作用 ， 但感染艱難梭菌的患者通常會(huì)減少類桿菌的豐度和多樣性 。 作者的數(shù)據(jù)可能表明 ， 如果沒有先前的微生物群干擾 ， 例如使用抗生素治療 ， 艱難梭菌不能減少擬桿菌的數(shù)量 ， 而是通過改善生長(zhǎng)來加強(qiáng)擬桿菌的優(yōu)勢(shì) 。 結(jié)論
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