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科研 | mSphere：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個體間相互作用的研究( 二 )


科研 | mSphere：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個體間相互作用的研究
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圖2 長期追蹤的9種腸道微生物群 ， 使用PMA-qPCR追蹤混合生物膜內細菌數量的物種特異性變化 。 CT值使用我們的管道進行轉換來表示細菌總數 。 圖中顯示了混合生物膜內6、24、48、和72小時的個別物種的細菌數 。 下表總結了通過anova和事后圖的多次比較測試計算出的不同物種在時間上的顯著差異 。 P值：ns ， 不顯著；****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05 。 數據顯示的是三個獨立生物實驗的平均值 ， 一式三份 。 錯誤欄表示標準偏差 。3 微生物群的種類會干擾艱難梭菌的粘附性和生長為了研究腸道病原菌對腸道微生物群落動態的影響 ， 作者選擇了艱難梭菌作為醫院內病原菌 。 首先 ， 為了研究微生物群對艱難梭菌粘附的影響 ， 跟蹤了在有和沒有艱難梭菌的情況下6小時內粘附生物膜的形成 。 測量了能夠粘附在24孔聚苯乙烯板上的初始接種物的百分比 。 當艱難梭菌與微生物群一起培養時 ， 與艱難梭菌單一培養對照相比 ， 在艱難梭菌中觀察到初始粘附顯著減少（圖3A） 。 雖然顯著 ， 但這種減少很小 ， 單獨培養時 ， 初始接種物的粘附率為5% ， 微生物群的粘附率為2% 。 關于微生物群 ， 作者發現當與艱難梭菌一起培養時 ， 粘附的細菌數量顯著增加 。 大腸埃希菌、青春期雙歧桿菌和瘤胃球菌在統計學上存在顯著差異 ， 但這種趨勢在所有物種中普遍存在（圖3A） 。 在這個早期階段 ， 大腸桿菌似乎占主導地位 ， 其原始接種物的粘附量遠遠超過任何其他物種 。 大腸桿菌是目前唯一的兼性物種 ， 因此任何殘留在還原培養基中的氧氣都可能為它提供了一個最初的開端 。 作者研究了生物膜形成過程中對艱難梭菌的影響（圖3B） 。 在這里 ， 微生物群影響艱難梭菌的生長 ， 與艱難梭菌單一培養對照相比 ， 在所有時間點都顯著降低了艱難梭菌的生長 。 這一影響在24小時最高 ， 微生物群導致難擴散菌數量比單培養對照下降20倍 。 由于粘附后抑制作用的增強 ， 艱難梭菌數量的減少很可能是由于微生物群對艱難梭菌生長產生負面影響 ， 而不是難粘附艱難梭菌 。 在艱難梭菌存在下 ， 作者跟蹤了構成代表性微生物群的九種物種中的每一種（圖4） 。 與微生物對照相比 ， 作者發現艱難梭菌的存在具有從中性到陽性的效果 ， 其中6種對B. dorei、B. Hanseni、B. ovatus、大腸桿菌、F. Prusniziii有小但顯著的差異 ， 而在6h和/或24 h和48 h時 ， 苦參雖然能增加微生物群的初始結合 ， 但其作用并不長期 。 在這兩種情況下 ， 無論是先前的軌跡 ， 72 h的數量都有所減少 ， 這可能是由于培養基中缺乏足夠的營養物質或在這個后期 ， 副產物的有毒水平積累所致 。
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圖3 艱難梭菌與共生微生物群落的相互作用 。 （A）艱難梭菌的存在影響粘附微生物群落中幾個物種的粘附 。 9種微生物群落、9種難擴散桿菌和單種艱難生物膜控制（僅擴散生物膜）中6 h后附著的接種菌百分比 。 （B）微生物群對艱難梭菌有抑制作用 。 采用PMA-qPCR法 ， 對在單一培養生物膜或具有9種代表性微生物群中培養72小時的艱難梭菌數量進行跟蹤 。 所示數據均為三次獨立實驗的平均值 。 雙向方差分析表明兩種情況之間存在顯著差異（P值< 0.0001） ， 使用事后Sidak檢驗確定具體差異 。 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05 。
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圖4 追蹤艱難梭菌對腸道微生物群落中單個物種的影響 。 使用PMA-qPCR追蹤的72小時內代表性微生物群和艱難梭菌生物膜內單個物種的細菌數量與沒有艱難梭菌的對照微生物群生物膜相比顯示 。 所示數據是三次獨立實驗的平均值 。 使用雙向方差分析確定兩種情況之間的顯著差異 ， 并使用事后Sidak檢驗確定特定差異 。 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P <0.05 。4 艱難梭菌與已建立的微生物生物膜的相互作用通常情況下 ， 處于健康狀態的微生物群在艱難梭菌感染之前就已經建立 。 為了更好地復制這一點 ， 而不是同時引入艱難梭菌作為微生物群 ， 作者在引入艱難梭菌之前預先建立了24小時的微生物群生物膜（圖5A） 。 當將其與生長相同時間的艱難梭菌單一培養物進行比較時 ， 觀察到 ， 在添加24小時和48小時后 ， 已建立的微生物群對艱難梭菌具有顯著的抑制作用 。 艱難梭菌數量的最大差異（138倍）出現在添加后24小時 。 預先建立的微生物群對艱難梭菌的影響明顯大于兩者同時播種時的影響（圖5B） 。 雖然這很有趣 ， 但艱難梭菌數量的減少可能不是病原體特異性的影響 。 為了驗證這一點 ， 作者還研究了脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis） ， 一種腸道共生菌和病原體 ， 或者與微生物群共同培養 ， 或者加入預先建立的群落 。 作者觀察到 ， 與單一培養的脆弱雙歧桿菌生物膜相比 ， 當與微生物群共培養或添加到預先建立的群落中時 ， 脆弱雙歧桿菌的數量較低 。 然而 ， 與艱難梭菌不同 ， 當添加到預先建立的群落中時 ， 脆弱雙歧桿菌的數量高于與微生物群一起播種時的數量 。 這些結果可能表明病原體與已建立的群落的相互作用具有一定的特異性 。 作者追蹤微生物群中的每一種 ， 以檢查對艱難菌反應的任何變化（圖6） 。 作者期望 ， 隨著微生物群的建立 ， 與艱難菌接種時相比 ， 難擴散菌對微生物群的影響都會降低 。 然而 ， 令人驚訝的是 ， 發現了相反的事實 。 與僅微生物對照相比 ， 只有兩種品種 ， 即B.Hanseni和R.gnavus ， 與同時添加難溶性艱難菌相比 ， 數量沒有變化 。 另外7種在引進艱難菌時 ， 均表現出顯著差異（圖6） 。 在接種艱難菌后24 h（微生物接種48h） ， 發現對B. Thetaiomation和大腸桿菌有積極的作用 。 F. prausnitzii有小幅下降 。 在感染艱難菌后48h ， 仍然可以看到對大腸桿菌的陽性作用 ， 但在較小程度上 。 值得注意的是 ， 在48小時時 ， 與微生物群對照相比 ， 該藥物的數量有所減少 ， 低于作者的檢測限 。 因此 ， 盡管同時培養和預穩定微生物群之間受艱難菌影響的物種是不同的 ， 但在這兩種情況下 ， 有幾個物種受到影響 ， 其中就包括類桿菌 。

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