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科研 | mSphere：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個(gè)體間相互作用的研究

導(dǎo)讀 腸道微生物群內(nèi)共生細(xì)菌的相互作用以及與入侵病原體的相互作用是決定感染結(jié)果的關(guān)鍵 。 雖然小鼠研究很有價(jià)值 ， 但缺乏體外模型來監(jiān)測單一物種水平上的病原體對群落的反應(yīng) 。 作者建立了一個(gè)由9個(gè)代表性腸道物種組成的多物種群落 ， 作為一個(gè)混合生物膜一起培養(yǎng) ， 并使用基于定量PCR（qPCR）的方法跟蹤單個(gè)物種的數(shù)量 。 將主要的醫(yī)院內(nèi)腸道病原菌艱難梭菌引入該群落 ， 可增加共生菌的粘附力 ， 抑制艱難梭菌的增殖 。 有趣的是 ， 作者觀察到 ， 隨著艱難梭菌的抑制 ， 個(gè)別類桿菌種類卻逐漸增加 。 此外 ， 類桿菌減少了艱難梭菌在生物膜內(nèi)的生長 ， 這表明類桿菌在預(yù)防艱難梭菌定植中的作用 。 本研究定義的體外群落可以根據(jù)不同物種進(jìn)行不同定制 ， 非常適合功能基因組 ， 是理解細(xì)菌間相互作用的寶貴工具 。
論文ID

原名：Dissecting Individual Interactions between Pathogenic and Commensal Bacteria within a Multispecies Gut Microbial Community
譯名：多菌種腸道微生物群落中病原菌與共生菌個(gè)體間相互作用的研究
期刊：mSphere
IF：4.282發(fā)表時(shí)間：2021.3.24
通訊作者：Meera Unnikrishnan
通訊作者單位：英國考文垂華威大學(xué)華威醫(yī)學(xué)院
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
所有菌株在37°C厭氧條件下培養(yǎng) 。 對于具有多種微生物的混合生物膜 ， 單獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)物在SAB1中培養(yǎng)16至18小時(shí)（在37°C的厭氧柜中過夜） 。 然后用新鮮的SAB1稀釋這些培養(yǎng)物 ， 使混合培養(yǎng)物中每種物種在600 nm（OD600）處的最終濃度達(dá)到0.1光密度 ， 測定微生物的生物膜 。 在DNA提取之前 ， 將單氮化鈉（PMA；生物氚）添加到40mM最終濃度的再懸浮樣品中 ， 在黑暗中孵化10分鐘（在厭氧柜中培養(yǎng)37°C） ， 隨后基于苯酚氯仿的方法進(jìn)行了DNA的萃取 ， 采用實(shí)時(shí)定量的PCR(qPCR)測定差異基因 ， 從而對艱難梭菌和多雷梭菌生物膜進(jìn)行深入研究 。
結(jié)果
1 開發(fā)混合生物膜群落 ， 優(yōu)化單氮化原(PMA)-QPCR跟蹤方法為了開發(fā)一個(gè)由具有代表性的腸道物種組成的復(fù)雜的混合生物膜群落 ， 作者根據(jù)之前描述健康腸道微生物群物種的文獻(xiàn) ， 總共選擇了9種腸共生物種（表1） 。 該物種的選擇是基于高相對豐度、在多個(gè)地區(qū)（歐洲、美國和亞洲）存在 ， 以及序列基因組的可用性 。 細(xì)菌和細(xì)菌被過度代表 ， 這些屬是腸道的優(yōu)勢門 。 如材料和方法所述 ， 這九種物種作為混合生物膜一起培養(yǎng) 。 為了追蹤單個(gè)物種 ， 引物被設(shè)計(jì)為針對每個(gè)菌株的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(頂部I)或DNA環(huán)轉(zhuǎn)酶亞基A(gyrA)區(qū)域 。 選擇這些基因是與傳統(tǒng)的16S基因不同 ， 它們基因組中只有一個(gè)拷貝數(shù) ， 這提高了將DNA質(zhì)量轉(zhuǎn)化為細(xì)菌數(shù)的假設(shè)的準(zhǔn)確性 。 為了準(zhǔn)確地量化細(xì)菌 ， 必須只量化活性細(xì)胞/活細(xì)胞 。 標(biāo)準(zhǔn)的qPCR量化了所有的細(xì)胞 ， “死亡的”和“活躍的”一樣 ， 這給出了一個(gè)種群中個(gè)體物種的不準(zhǔn)確的豐富度 。 為了提高定量的準(zhǔn)確性 ， 作者使用單氮化原鈉(PMA)來防止“死亡”細(xì)菌的計(jì)數(shù) ， 即那些細(xì)胞膜受損的細(xì)菌 。 PMA是一種光活化的DNA結(jié)合染料 ， 只能針對細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞或“死亡”細(xì)胞 。 當(dāng)PMA被光激活時(shí) ， 它與雙鏈DNA(dsDNA)共價(jià)結(jié)合 ， 交聯(lián)兩條鏈 ， 這種結(jié)合可以防止在PCR的過程中的DNA擴(kuò)增 。 因此 ， 生物膜樣本首先用優(yōu)化濃度的PMA進(jìn)行處理 ， 然后進(jìn)行基因組DNA提取 ， 然后用QPCR進(jìn)行分析（圖1) 。表1 用于構(gòu)建腸道微生物群落的有代表性的物種一覽表
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圖1 用于量化混合生物膜中單個(gè)物種管道的示意圖 。 樣本為PMA（單氮原）處理 ， 以確保只有活細(xì)胞的基因組DNA定量 。 治療后 ， 將細(xì)胞裂解 ， 提取DNA ， 然后對DNA進(jìn)行QPCR定量 ， 隨后轉(zhuǎn)化為細(xì)菌數(shù) 。2 跟蹤微生物群群落內(nèi)的單個(gè)物種作者首先在一個(gè)包含9種生物的混合生物膜中跟蹤單個(gè)物種的數(shù)量 。 在孵育至72小時(shí)的不同時(shí)間后檢測到所有9個(gè)物種（圖2） 。 青春期雙歧桿菌和卵形雙歧桿菌在早期（72小時(shí)前）均呈陽性趨勢 ， 而熱帶雙歧桿菌保持不變 ， 所有其他物種的數(shù)量均減少 。 72小時(shí)時(shí) ， 所有物種的數(shù)量都出現(xiàn)了衰退 ， 這意味著培養(yǎng)基中有毒副產(chǎn)物的積累 ， 或營養(yǎng)耗盡 。 接種物中某些物種（類桿菌和類桿菌）的較低細(xì)菌數(shù)量（盡管通過光密度使數(shù)量正常化）似乎影響其在混合生物膜中的數(shù)量 。 結(jié)果表明 ， 生物膜內(nèi)的物種 ， 甚至同一屬內(nèi)的物種 ， 表現(xiàn)出不同的行為 ， 類桿菌在最初的48小時(shí)內(nèi)有陽性、中性和陰性趨勢 。 值得注意的是 ， 當(dāng)混合生物膜與單一細(xì)菌物種生物膜進(jìn)行比較時(shí) ， 某些群落成員的數(shù)量有顯著變化 。 與單一生物膜培養(yǎng)物相比 ， 混合生物膜中的卵雙歧桿菌和漢森布氏桿菌的數(shù)量在24小時(shí)時(shí)有所增加 ， 而其他成員 ， 如海洋雙歧桿菌、真桿菌和大腸桿菌的數(shù)量則分別減少了80倍、25倍和20倍 ， 這些差異進(jìn)一步表明 ， 單個(gè)細(xì)菌的動態(tài)受細(xì)菌群落內(nèi)相互作用的影響 。 此外 ， 作者還測試了選定的成對細(xì)菌物種 ， 以比較它們在雙物種生物膜和微生物群生物膜中的行為 。 作者研究了大腸桿菌培養(yǎng)與選定的物種是代表不同的門包括在群落 。 對于大腸桿菌而言 ， 當(dāng)與任何一種除顎形瘤胃球菌外的細(xì)菌一起孵育時(shí) ， 細(xì)菌數(shù)量沒有變化 ， 這與混合群落中24小時(shí)內(nèi)未變化的大腸桿菌數(shù)量相比（圖2） 。 然而 ， 在與大腸桿菌共培養(yǎng)的生物膜中 ， 多雷雙歧桿菌和漢森雙歧桿菌生長得更好 ， 而青春期雙歧桿菌和顎形瘤胃球菌生長得不太好 ， 與各自的生物膜單一培養(yǎng)物相比 ， 早熟糞桿菌保持不變 。 這些生長行為不同于微生物群落中觀察到的（圖2） 。 因此 ， 雙物種生物膜相互作用與微生物群落中觀察到的相互作用有很大的不同 。

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