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專家論壇｜尹明：HBV感染的動物模型研究進展( 三 )


通過小鼠的脾臟異種移植人原代肝細胞(PHH) ， 可以整合到免疫缺陷的肝損傷小鼠的肝實質中 。 這樣獲得的人鼠嵌合肝臟小鼠可以更好的模擬HBV自然感染和cccDNA復制過程 。 目前 ， 文獻報道或商品化的主要有5種人源化肝臟小鼠模型(表 2) 。

專家論壇｜尹明：HBV感染的動物模型研究進展
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尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)在細胞外基質的降解過程中發(fā)揮重要作用 。 uPA系統(tǒng)包括uPA、uPA受體和它的2種抑制劑——纖維蛋白溶酶原激活質抑制物PAI-1和PAI-2 。 纖溶酶通過直接或間接激活基質金屬蛋白酶(MMP)來降解細胞外基質和層黏連蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白聚糖、Ⅳ型膠原等基膜成分 。 uPA參與多種生理和病理過程 ， 在肝臟再生過程中uPA通過激活纖溶酶清除壞死的細胞 ， 并且能夠降解胞外基質促進肝小葉結構的重建 。 早在1991年Sandgren等[43]就做出了Alb-uPA轉基因小鼠 ， 由于uPA的肝毒性 ， Alb-uPA小鼠在出生4天就會出現(xiàn)出血癥狀 。 2000年Weglarz等[44]作了改進 ， 制作了MUP-uPA轉基因小鼠 ， 使用MUP增強子/啟動子在肝細胞中特異性表達uPA ， 用來研究肝細胞移植 。 與Alb-uPA類似 ， 由于基因丟失 ， uPA的表達會逐漸降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2~4周之后才會開始表達uPA ， 從而降低新生小鼠的病死率 。 MUP-uPA小鼠的人源化肝臟重建水平比較低 。 2004年 ， Tateno等[45]報道了uPA-SCID小鼠 ， 可以高水平人源化重建小鼠肝臟 。 uPA-SCID小鼠需要在出生后2周內重建肝臟 ， 繁殖比較困難 ， 屬于不能調控的肝損傷模型 。 5.2 FRG小鼠2007年 ， Azuma等[46]報道了FRG小鼠 ， 即將延胡索乙酰乙酸水解酶基因(Fah)敲除小鼠回交到Rag2-/- &Il2rg-/-敲除的高度免疫缺陷背景 ， 可以實現(xiàn)高水平的人源化重建 。 小鼠Fah基因敲除后 ， 酪氨酸在體內代謝障礙 ， 造成延胡索乙酰乙酸(FAA)積累 ， 從而引起肝細胞的損傷 。 NTBC是4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶的抑制劑 ， 可以阻止FAA的積累 ， 服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血癥的癥狀 。 FRG小鼠繁育時喂飼低酪氨酸日糧或者飲水補充NTBC 。 若需要肝損傷重建時 ， 可以逐步撤去NTBC ， 屬于可調控肝損傷模型 。 5.3 TK-NOG小鼠TK-NOG小鼠是另一種誘導性肝損傷模型 ， 由白蛋白啟動子驅動單純皰疹病毒肝特異性表達病毒1型胸苷激酶(HSVtk) ， 然后回交到NOD/Shi scid小鼠背景[47] 。 因為陽性雄鼠不育 ， 這個模型擴繁困難 。 5.4 AFC8小鼠2011年 ， Washburn等[48]報道了一種在Alb啟動子之后表達融合蛋白FK506結合蛋白(FKBP)和caspase8的轉基因小鼠(AFC8) ， 該小鼠模型受到AP20187(一種二聚體FKBP)選擇性調控 ， 然后通過回交的方式獲得了Balb/C Rag2-/-&Il2rg-/-背景的AFC8小鼠 。 這個模型的人源化肝重建水平比較低(約30%) 。 5.5 URG?小鼠該模型是國內最早的人源化肝臟小鼠模型 。 URG小鼠由4種基因修飾動物模型交配獲得 ， 包含2個轉基因和2個基因敲除 。 其核心模型源于2009年Song等[49]構建了TRE-uPA轉基因小鼠和Alb-rtTA轉基因小鼠 ， 然后交配獲得了Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠；通過Dox誘導 ， 在該小鼠中檢測到uPA表達和肝損傷 。 北京維通達生物技術有限公司的研發(fā)人員將Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠連續(xù)8代回交到NRG(NOD背景Rag2null/ Il2rgnull小鼠)背景 ， 2012年獲得Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠 。 作為新一代的可調控肝損傷人源化肝臟小鼠模型 ， 人源肝臟細胞可以實現(xiàn)高達95%整肝重建 ， 滿足HBV藥物的藥效、藥代和藥動等相關實驗需要 。 使用該模型 ， 也發(fā)表了一系列高水平研究論文[50-53] 。 宿主免疫應答在HBV感染中起著至關重要的作用 ， 然而上面5種人鼠嵌合肝臟小鼠 ， 均為高度免疫缺陷背景 ， 無法直接用于HBV特定的免疫和炎性反應研究 。 Washburn等[48]開發(fā)了一種人源化小鼠模型(AFC8-hu-HSC/Hep小鼠) ， 共移植人CD34+造血干細胞(HSC)與肝細胞祖細胞進入新生(出生后第1周內)的轉基因小鼠 ， 同時具有人類免疫系統(tǒng)和人的肝細胞 。 但是這個模型人肝細胞重建水平低 ， 也未檢測到抗原特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞反應 。 2014年 ， 這個小組建立了A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep雙人源化小鼠模型(人HLA-A2轉基因的NSG小鼠) ， 人HLA-A2轉基因促進人MHC限制性T淋巴細胞的發(fā)育；小鼠特異性抗Fas激動劑治療抗體(JO2)支持人體免疫細胞和肝細胞的再增殖[54] 。 A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep小鼠可支持持續(xù)性HBV感染(＞4個月)與HBV特異性人類免疫有關的肝纖維化；而且在HBV感染的嵌合肝臟中 ， 觀察到活化的人M2樣巨噬細胞聚集 ， 這與HBV引起的急性和慢性感染相似 。 但是 ， 該模型移植的細胞來源于流產(chǎn)胎兒組織 ， 存在倫理問題的限制 。 2015年, Strick-Marchand等[55]報道 ， 使用BRGS-uPA小鼠(BALB/c Rag2-/- &Il2rg-/- NOD.sirpa uPAtg/wt) 實現(xiàn)了更高水平的雙人源化重建 。 在BRGS-uPA小鼠出生后(＜1周齡)輻照并移植CD34+造血干細胞重建人源性免疫系統(tǒng)；在4~8周時移植成年人肝細胞重建肝臟 。 嵌合肝臟重建水平可以達到20%~50% ， 且在嵌合肝臟中檢測到了多種免疫細胞亞群 ， 可以檢測到幼稚的T淋巴細胞(CD45RA+)和成熟的B淋巴細胞 ， 以及人源的Igs抗體 。 盡管人類HSC和人肝細胞的HLA不匹配 ， 但未觀察到任何移植物排斥反應 。 由于肝細胞移植是在HSC注射后4~8周內進行 ， 即在成熟T淋巴細胞出現(xiàn)在外周器官之前 ， 研究人員推測肝細胞產(chǎn)生的同種異體抗原 ， 呈現(xiàn)給發(fā)育中的胸腺細胞 ， 使其具有耐受性；另一個解釋是肝臟微環(huán)境的耐受性 ， 肝內抗原呈遞細胞可以將免疫應答向免疫調節(jié)表型傾斜 ， 從而保護肝細胞免受免疫攻擊 。 在HBV肝細胞感染期間 ， 免疫反應在介導病毒根除或持續(xù)存在中起著重要作用 。 這種新型的雙人源化模型可能是研究單感染和共感染免疫反應的一個合適的平臺 ， 可以應用于測試新的治療策略或候選疫苗 。 2019年Yuan等[56]使用FRGS小鼠(Fah-/-Rag2-/-IL-2R-/-SCID)移植了人類骨髓間充質干細胞(hBMSCs) ， 可以轉分化為雙人源化小鼠模型(hBMSC-FRGS) ， 但重建水平比較低 。 盡管肝臟和免疫雙人源化小鼠模型理論上是完美的模型 ， 目前仍受到生產(chǎn)困難、高成本和一系列倫理等因素限制 。 6小結

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