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專家論壇｜尹明：HBV感染的動物模型研究進展( 二 )


利用瞬態(tài)水動力機械地(高壓)將HBV DNA擠入肝細胞 ， 可以導致短暫的HBV復制以及蛋白質(zhì)合成 。 2002年 ， Yang等[24]首次建立了HBV水動力注射小鼠模型 。 在小鼠尾部靜脈 ， 通過注入大量生理鹽水 ， 相當于小鼠體質(zhì)量的8%~10% ， 其中含有1.3倍HBV基因組DNA的質(zhì)粒 ， 在很短的時間內(nèi)(5~8 s)注射到小鼠靜脈內(nèi) 。 但是隨著小鼠體內(nèi)HBV特異性抗體和細胞毒性T淋巴細胞的出現(xiàn) ， 血液中的HBV抗原通常在第7天消失；而肝臟HBV轉(zhuǎn)錄物在轉(zhuǎn)染后第15天被清除 ， 與抗病毒抗體和抗病毒CD8+T淋巴細胞的出現(xiàn)相吻合 。 在NOD/SCID小鼠中缺乏功能性T和B淋巴細胞、HBV基因表達和復制可以持續(xù)超過81天 ， 表明宿主的免疫反應(yīng) ， 特別是病毒特異性CTL反應(yīng)可能在抗HBV中起重要作用 。 HDI小鼠模型是一種方便、可行的方法 ， 直接用于不同基因型、變異或突變的HBV模型構(gòu)建 。 而且HBV基因組沒有整合到宿主基因組中 ， 為研究HBV免疫反應(yīng)和發(fā)病機制提供了可能 。 然而 ， 水動力注射程序?qū)е聡乐氐母螕p傷 ， 使實驗結(jié)果的解釋復雜化 ， 尤其是在免疫反應(yīng)和發(fā)病原因方面造成混淆[25] 。 另外 ， 低的轉(zhuǎn)染效率(5%~10%)和持續(xù)時間短也限制了該模型的使用[26-27] 。 另外 ， 小鼠的遺傳背景、年齡、性別和免疫系統(tǒng)狀態(tài)等也會影響HDI小鼠模型中HBV在體內(nèi)的持久性[24, 28]3AAV-HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型
2001年 ， Sprinzl等[29]開發(fā)了腺病毒載體攜帶1.3倍的鴨HBV基因組(Ad-DHBV) ， 經(jīng)尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)的方法 。 采用類似的方法 ， von Freyend等[30]將含有1.3倍HBV基因組的腺病毒載體(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠體內(nèi) ， 在小鼠肝臟中檢測到3個月以上的HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 。 由于腺病毒載體很大 ， 同時編碼一些非HBV病毒產(chǎn)物 ， 這些產(chǎn)物也可能誘導免疫反應(yīng)來清除HBV[31] 。 肝細胞靶向AAV載體具有低免疫原性的特點 ， 將AAV-HBV通過小鼠尾靜脈注射 ， 成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33] 。 這類模型可以持續(xù)產(chǎn)生HBV病毒顆粒和HBV抗原且1年以上無血清轉(zhuǎn)化 ， 重現(xiàn)了臨床CHB患者的部分免疫學特征 。 因而 ， AAV-HBV模型也被用于評估新的基于免疫的療法和抗病毒治療[34] 。 目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒載體 ， 經(jīng)尾靜脈注射到野生C57BL/6小鼠體內(nèi) ， 其表達水平隨重組病毒注射劑量的增加而升高 ， 高劑量注射時可造成超過40%的肝細胞感染HBV ， 血清中HBV DNA可達105 IU/ml 。 但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差別 。 2017年Lucifora等[35]報道通過Southern印跡分析可檢測到AAV-HBV中存在cccDNA ， 然而這些cccDNA ， 是不是通過小鼠肝細胞中的rcDNA前體產(chǎn)生的仍不清楚 ， 目前也無新的研究報道 。 另外在這些模型中 ， HBV的復制不是由cccDNA直接驅(qū)動的 ， 而且重組AAV基因組進入體內(nèi)后 ， 一部分可以形成大的多聚體并整合到宿主基因組中 ， 從而使得這些模型與cccDNA的相關(guān)性降低[36] 。 盡管如此 ， AAV-HBV模型仍是用于評估免疫療法和抗病毒治療的主要模型 。 4cccDNA替代小鼠模型
HBV感染的人肝臟細胞中含有3.2 kb松弛環(huán)狀rcDNA ， 在細胞核中 ， rcDNA修復為cccDNA是病毒轉(zhuǎn)錄復制的起始模板 。 cccDNA轉(zhuǎn)錄的病毒前基因組RNA(pregenomic RNA ， pgRNA)在細胞質(zhì)內(nèi)包裝入核衣殼 ， 通過反轉(zhuǎn)錄起始病毒DNA合成 ， 成熟的病毒核衣殼顆粒再次轉(zhuǎn)運至細胞核 ， 完成細胞內(nèi)的病毒復制周期 。 HBV基因組高度壓縮 ， 難以容納外源性序列[37] 。 已經(jīng)開發(fā)了多種途徑 ， 通過體外重組生產(chǎn)cccDNA(rcccDNA)[38] ， rcccDNA與野生病毒cccDNA具有較大相似性 ， 能夠在細胞內(nèi)或體外系統(tǒng)大量誘導產(chǎn)生 ， 是HBV研究的一類重要工具 。 2014年Qi等[39]開發(fā)了一種基于HDI的重組cccDNA小鼠模型 ， 通過Cre/loxP介導的DNA重組在體內(nèi)生成cccDNA 。 在HBV基因組兩側(cè)引入同向LoxP位點 ， 由重組酶Cre引發(fā)LoxP位點之間的DNA重組和環(huán)化 ， 生成含有單拷貝LoxP位點的rcccDNA；LoxP位點則位于一段約90 bp的外源性內(nèi)含子中(HBsAg基因近5′端) ， 可在RNA轉(zhuǎn)錄過程中移除 ， 實現(xiàn)所謂的無縫插入 。 然而 ， 該模型中病毒復制水平較低 ， 體內(nèi)持續(xù)時間較短 ， 可能是由于轉(zhuǎn)染細胞中Cre依賴性重組酶激活了免疫系統(tǒng) 。 另外兩個含DNA的細菌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 ， 重組效率低 ， 導致cccDNA轉(zhuǎn)染肝細胞非常低 。 傳統(tǒng)的含有DNA的細菌質(zhì)粒 ， 導致體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的快速轉(zhuǎn)錄沉默 ， 即使載體DNA仍然保留在細胞中 。 Kay等[40]開發(fā)了一種PhiC31整合酶介導的分子內(nèi)重組技術(shù) ， 以制備無細菌主鏈的微型環(huán)載體DNA ， 可在體外和體內(nèi)表達高水平的轉(zhuǎn)基因 。 基于大腸桿菌PhiC31重組酶誘導表達系統(tǒng) ， 建立了一種體外誘導rcccDNA attR微環(huán)產(chǎn)生和純化的策略 ， 純化的rcccDNA attR微環(huán)具超螺旋結(jié)構(gòu) ， 能夠支持功能性的HBV復制和抗原表達 。 由于rcccDNA編碼中包含外源內(nèi)含子序列 ， 應(yīng)用引物特異性PCR方法易于與HBV DNA復制中間體及從頭合成的新生cccDNA區(qū)分 。 最近 ， 在采用復制缺陷腺病毒載體將rcccDNA轉(zhuǎn)入肝臟特異的Cre小鼠中檢測到HBV的時間超過62周[41] 。 在小鼠肝臟中 ， 觀察到了持續(xù)壞死性炎癥反應(yīng)、纖維化和肝硬化等病理學特征 ， 與臨床慢性肝炎相似 。 Yan等[42]發(fā)表的文章中 ， 將39 bp的attR位點設(shè)計插入在HBV多聚酶基因的spacer區(qū)(PreS1起始密碼子前) ， 顯示并不影響病毒復制 。 通過免疫正常的小鼠尾靜脈HDI注射rcccDNA ， 可短期誘導HBV抗原血癥(平均5~7周) ， 與急性HBV感染相似 。 他們比較了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三種小鼠 ， 其中C3H/HeN小鼠感染率最高 ， 半數(shù)以上小鼠體內(nèi)HBV復制持續(xù)1年以上 。 cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反應(yīng)和發(fā)病機制 ， 這也有助于評估cccDNA靶向抗病毒藥物策略 。 然而 ， 由于這類模型仍是小鼠的肝臟細胞 ， 不涉及HBV的入侵、擴散和再傳染的過程 ， 仍不能替代人鼠嵌合肝臟人源化小鼠模型 。 5人鼠嵌合肝臟小鼠模型

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