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專(zhuān)家論壇｜尹明：HBV感染的動(dòng)物模型研究進(jìn)展

HBV是一種嗜肝的DNA病毒 ， 會(huì)引起人類(lèi)急性或慢性肝炎 。 慢性乙型肝炎(CHB)是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要原因[1]1965年 ， Blumberg等[2]在澳大利亞土著人檢測(cè)到HBsAg ， 稱(chēng)為“澳大利亞抗原” 。 1970年 ， Dane等[3]通過(guò)電鏡檢測(cè)到HBV完整的病毒顆粒 ， 稱(chēng)為“丹氏顆粒” 。 HBV有嚴(yán)格的種屬特異性 ， 它的自然宿主限制在人類(lèi)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物身上 ， 包括黑猩猩(chimpanzees)、大猩猩(gorillas)、長(zhǎng)臂猿(gibbons)和猩猩(orangutans) 。 這些非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的研究 ， 受到倫理和飼養(yǎng)等限制 ， 只有很少的實(shí)驗(yàn)室有條件開(kāi)展 ， 并且黑猩猩在歐洲已被禁止用于實(shí)驗(yàn)研究[4] 。 直到2012年 ， 李文輝團(tuán)隊(duì)[5]發(fā)現(xiàn)HBV感染肝細(xì)胞的關(guān)鍵受體 ， 是鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)；穩(wěn)定表達(dá)人NTCP的HepG2細(xì)胞系(HepG2-NTCP ， 自然狀態(tài)下HepG2不能感染HBV)可以感染HBV 。 2016年 ， Lempp等[6]發(fā)現(xiàn) ， 小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)入人NTCP后可以支持HBV的進(jìn)入 ， 但不能轉(zhuǎn)錄、翻譯和形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA) 。 2017年 ， Lempp等[7]將食蟹猴、恒河猴和豬的肝細(xì)胞表達(dá)hNTCP ， 這些細(xì)胞變得HBV易感 ， 效率與人肝細(xì)胞相當(dāng) 。 以上研究表明 ， 不同物種間的差異 ， 如肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、微環(huán)境和(共)受體 ， 或者血液中的可溶性因子 ， 影響了HBV的易感性和感染效率 。 這也從側(cè)面表明 ， HBV侵入、修復(fù)、cccDNA形成(非必須)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、組裝、釋放、慢性感染和再?gòu)?fù)發(fā)機(jī)制的復(fù)雜性 ， 特別是還未弄清楚造成物種間差異的原因 ， 需要進(jìn)行更深入的基礎(chǔ)研究 。 目前CHB抗病毒治療通過(guò)口服核苷(酸)類(lèi)似物(NUCs)可抑制HBV復(fù)制 ， 安全性高 ， 但很少發(fā)生HBsAg清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換 ， 停藥無(wú)期；只能在不到10%的CHB患者中實(shí)現(xiàn)“功能性治愈” 。 皮下注射聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)可使10%~30%的患者清除HBeAg ， 并發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換 ， 兼具免疫調(diào)節(jié)特性；但耐受性差 ， 存在不良反應(yīng)[8] 。 在研的抗HBV藥物或者療法分為兩類(lèi)：(1)抑制或者沉默病毒的復(fù)制 ， 如HBV進(jìn)入抑制劑、cccDNA及其轉(zhuǎn)錄活性抑制劑、基因表達(dá)抑制劑、核衣殼組裝和pgRNA包裝抑制劑、HBsAg分泌抑制劑、RNAi和Crispr/Cas技術(shù)敲除等；(2)激活或者誘導(dǎo)免疫反應(yīng) ， 如免疫調(diào)節(jié)劑、干擾素、Toll樣(病原體識(shí)別受體)受體激動(dòng)劑、免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑、治療性疫苗和改造HBV特異性T淋巴細(xì)胞等[8-9] 。 理想的臨床前動(dòng)物模型既需要模型中有較高的HBV病毒含量 ， 也需要相應(yīng)的免疫環(huán)境 。 遺憾的是 ， 至今還沒(méi)有建立一個(gè)有效的模型 ， 能夠真實(shí)地再現(xiàn)HBV感染的免疫和發(fā)病機(jī)制 。 由于鴨子、土撥鼠和樹(shù)鼩是非標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4] ， 而hNTCP轉(zhuǎn)基因的食蟹猴、恒河猴和豬等模型還沒(méi)有成功的報(bào)道 ， 本文主要綜述小鼠HBV模型的最新進(jìn)展(表 1) ， 為臨床前HBV藥效實(shí)驗(yàn)和HBV相關(guān)研究提供參考 。

專(zhuān)家論壇｜尹明：HBV感染的動(dòng)物模型研究進(jìn)展
本文插圖


1HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型
在HBV啟動(dòng)子或者小鼠肝細(xì)胞特異啟動(dòng)子(如白蛋白啟動(dòng)子Alb)的控制下 ， 將編碼HBV蛋白的基因序列通過(guò)原核注射轉(zhuǎn)入到小鼠中 ， 獲得表達(dá)HBV蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠 ， 如病毒包膜(envelope ， S基因)[10-12]、核心(core ， C基因)[13]、前核心(precore ， preC基因)[14]和X基因[15-16] 。 這些模型對(duì)HBV的特性驗(yàn)證提供了重要的數(shù)據(jù)支持 。 隨后 ， 有兩個(gè)研究小組[17-18]用全長(zhǎng)或者超長(zhǎng)的HBV全基因序列制成轉(zhuǎn)基因小鼠 ， 然而僅在少數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠的器官中檢測(cè)到病毒復(fù)制和蛋白表達(dá) ， 其血清中病毒的滴度很低 。 在乙型肝炎抗病毒藥物篩選方面應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是Guidotti等[19]研發(fā)的 ， 其在HBV全長(zhǎng)序列5′末端重復(fù)一個(gè)C基因和X基因及其增強(qiáng)子 ， 構(gòu)建了1.3倍全長(zhǎng)HBV基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠 。 該小鼠血清中可檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBcAg ， 在小鼠體內(nèi)也檢測(cè)到完整病毒顆粒的形成 ， 且病毒顆粒具有感染性 。 該轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟和腎臟中有高水平的HBV表達(dá) ， 外周血清中的HBV DNA拷貝數(shù)高達(dá)107 IU/ml ， 其HBV抗原轉(zhuǎn)錄水平與CHB患者相當(dāng) ， 已經(jīng)成功用于HBV合成、轉(zhuǎn)錄 ， 病毒組裝和成熟的病毒分泌等抑制藥物的藥效實(shí)驗(yàn)[20-22] 。 然而 ， 由于轉(zhuǎn)基因模型中HBV整合在小鼠基因組上 ， 是組成型表達(dá)(在胚胎期即表達(dá)) ， 因而對(duì)HBV有天然的免疫耐受性 ， 不適宜于進(jìn)行免疫病理學(xué)方面的研究 。 另外 ， HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、轉(zhuǎn)錄 ， 病毒組裝及成熟的病毒分泌 ， 但未檢測(cè)到cccDNA形成 ， 尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23] 。 為了解決HBV抗原免疫耐受的問(wèn)題 ， 王軍等[1]綜述了不同的方案 ， 比如用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/- ， 和RAG1-/-等)雜交 ， 構(gòu)建了免疫缺陷背景的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 。 這些小鼠缺失T和B淋巴細(xì)胞 ， 給該小鼠過(guò)繼輸入相同遺傳背景的野生型小鼠脾臟細(xì)胞(T和B淋巴細(xì)胞) ， 使表達(dá)HBV的小鼠肝臟細(xì)胞暴露在重建的免疫系統(tǒng)中 ， 得到了類(lèi)似于人類(lèi)的HBV感染模型 ， 但其操作過(guò)程比較復(fù)雜 ， 且與人類(lèi)感染HBV后引起肝臟炎癥的自然病程相比仍有較大差別 ， 表明鼠肝臟中存在與人肝臟細(xì)胞不同的特征 ， 如存在不易感HBV的微環(huán)境或者結(jié)構(gòu)等 。 另一種解決HBV抗原免疫耐受問(wèn)題的方法是通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng) ， 如Tet-on系統(tǒng) ， 在特定的時(shí)間及部位(肝臟)誘導(dǎo)HBV基因表達(dá) ， 但該類(lèi)模型同樣存在肝炎特征與人類(lèi)肝炎差別較大的問(wèn)題 。 2HDI小鼠模型

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