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STM｜以毒攻毒：哈佛醫學院董民團隊攻克肉毒桿菌中毒難題


肉毒素是一類由革蘭氏陽性菌肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）及同屬相近菌所產生的蛋白質毒素 。 該毒素家族目前已知有七種亞型（BoNT/A到BoNT/G）【1】 。 該類毒素是目前自然界中已知的毒性最高的毒素之一 。 在美國 ， 肉毒素被列為六類最危險的管制藥物之一 ， 是潛在的生物恐怖襲擊制劑 (Arnon et al., 2001) 。 這類神經毒素特異性的靶向宿主運動神經 ， 阻斷神經遞質的傳遞 ， 造成肌肉麻痹和松弛性癱瘓 ， 導致病人行動無力和無法呼吸 。 七種亞型中 ， BoNT/A和BoNT/B所導致的肉毒桿菌中毒居多 。 得益于肉毒素對運動神經元的特異性 ， A和B亞型也被越來越多的用于治療由神經過度興奮引發的肌肉障礙相關的各種疾病 。 肉毒素為大眾所熟知的應用是在美容上用于消除皺紋 。
肉毒素家族蛋白是由單一基因編碼的雙鏈蛋白 ， 該蛋白在合成后需由蛋白酶激活從而切割成兩條鏈 ， 包括輕鏈和重鏈 。 輕鏈由蛋白酶結構域組成 ， 其本身是一種蛋白酶 ， 可以特異性的切割神經元內負責囊泡與細胞膜融合的相關蛋白 ， 包括VAMP1 ， 2和3 ， SNAP-25以及Syntaxin 1 。 正是由于輕鏈的這一特性 ， 它是肉毒素能夠阻斷神經信號傳遞的最終執行者 。 重鏈包含兩個結構域 ， 位于N端的跨膜區及C端的受體結合區 。 在蛋白質結構層面上 ， 三個結構域相對獨立 ， 分工明確 。 受體結合結構域負責識別在神經元上的特異受體；跨膜結構域協助輕鏈轉移到細胞內部；輕鏈在胞質內切割底物從而阻斷神經遞質的釋放 。
對于治療由BoNT/A與BoNT/B所導致的肉毒桿菌中毒 ， 其主要的難點在于毒素進入神經元后其輕鏈在細胞質中的半衰期極長 ， 從而導致持續性的神經阻斷及肌肉癱瘓 。 這些癥狀可以持續數月 ， 臨床上還沒有藥物能夠抑制已經進入神經元內的毒素 。 一旦中毒 ， 病人需要得到深度護理及輔助性的呼吸裝備得以維持生命 ， 這一過程長達數周至數月不等 。 由于周期長 ， 肉毒桿菌中毒的治療會導致高昂的醫療費用 。 而且一旦遇到大規模爆發 ， 極易導致醫療設施的短缺 。
開發治療肉毒桿菌中毒的藥物的研究由來已久 ， 但迄今為止 ， 還沒有小分子藥物能在神經元內有效的抑制肉毒素的酶活性 。 抗體藥物也僅能中和循環系統中存留的毒素 。 2020年1月7日 ， 哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的董民博士的實驗室在Science Translational Medicine在線發表了題為“Delivery of single-domain antibodies into neurons using a chimeric toxin–based platform is therapeutic in mouse models of botulism”的文章 ， 該研究用蛋白工程的方法開發了以融合毒素為平臺將納米抗體遞送至神經元細胞內來治療肉毒桿菌中毒 ， 為快速有效的治愈肉毒桿菌中毒迎來了新的曙光 。
在此項研究中 ， 作者充分利用了肉毒素極高的神經特異性 ， 用基因工程突變的方法開發了失去毒性的肉毒素 ， 并用其為載體將納米抗體遞送至神經元細胞內去中和A亞型和B亞型毒素 。 在此之前 ， 已有其他實驗室嘗試過利用失活的BoNT/A 和BoNT/C等傳統肉毒素亞型作為藥物遞送工具 。 盡管這些載體在經過突變后在體外并不具有酶活性 ， 但被注射到小鼠體內后 ， 小鼠仍然表現出肉毒桿菌中毒的癥狀及死亡 ， 其背后機制尚不明朗 。 為解決這一安全性上的問題 ， 董民博士的實驗室另辟蹊徑 ， 嘗試改造了一種新發現的肉毒素亞型BoNT/X 。 這種毒素是董民博士的實驗室于2017年發現的一種新型類肉毒素 ， 具有很多特別的生化特性 ， 包括更廣譜的底物切割及更高效的轉膜結構域 (Zhang et al., 2017) 。 因為BoNT/X本身不靶向運動神經元 ， 作者只利用了X型毒素的蛋白酶結構域和跨膜結構域作為藥物跨膜轉運工具 ， 同時用A, C, D肉毒素亞型的受體結構域來靶向運動神經元 ，從而產生了人造的嵌合型肉毒素（稱作BoNT/XA ， BoNT/XC和BoNT/XD） ，并通過突變關鍵的X型毒素酶活性位點的方法去除毒性用以作為遞送載體 。
在將針對A亞型的納米抗體（A8）與去除毒性的BoNT/XA ， BoNT/XC和BoNT/XD融合后（下文稱作A8-ciBoNT/XA ， A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD ， 見圖一） ， 作者首先在體外培養的神經元上對其進行了測試 ， 發現這些融合蛋白均能有效的抑制已進入神經元內的A亞型毒素的活性 ，其中以A8-ciBoNT/XA的抑制效果最佳 。 接下來作者對這些融合蛋白在小鼠內的毒性進行了評估 。 當給小鼠注射100 mg/kg的A8-ciBoNT/XA ， A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD時 ， 小鼠仍然無任何中毒癥狀 ，從而解決了一直以來困擾的殘余毒性問題 。

STM｜以毒攻毒：哈佛醫學院董民團隊攻克肉毒桿菌中毒難題

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