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克里米亞-剛果出血熱病毒幸存者體內(nèi)分離出人源保護(hù)性中和抗體





撰文 | 望夜

責(zé)編 | 兮

2018年 ， 世衛(wèi)組織將包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒、MERS、SARS在內(nèi)的10種病毒病列為優(yōu)先考慮的傳染性病原 ， 其中也包括克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fever virus ， CCHFV） 。

CCHFV是一類由蜱蟲傳播的可以引起嚴(yán)重出血熱癥狀的烈性病毒 ， 感染致死率通常在5%-30% ， 但在某些暴發(fā)波次甚至高達(dá)80% ， 需要在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中操作 。 CCHFV隸屬布尼亞病毒目（Bunyavirales）下的內(nèi)羅病毒科（Nairoviridae） ， 是一類分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒 。 CCHFV通常由攜帶病毒的璃眼蜱屬（Hyalomma）叮咬傳播或接觸被病毒污染的家畜而感染 ， 也曾有院內(nèi)感染的報(bào)道 。 該病毒已經(jīng)波及歐亞非多國并形成本地流行 ， 成為傳播范圍最廣的蜱傳病毒 。 目前尚無特效治療藥物 。

CCHFV的基因組分成三個(gè)節(jié)段（S、L、M） ， 分別編碼核蛋白、糖蛋白前體及RNA依賴的RNA聚合酶 。 依照M節(jié)段序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 ， CCHFV分為七個(gè)分支（clade I-VII） 。 糖蛋白前體經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯加工 ， 生成病毒囊膜表面的兩種結(jié)構(gòu)蛋白Gn和Gc ， 及三種分泌型蛋白（GP38、GP85、GP160） ， 其中 ， Gn負(fù)責(zé)病毒顆粒對(duì)受體細(xì)胞的粘附 ， Gc介導(dǎo)膜融合 。 類似于其它布尼亞病毒 ， 目前認(rèn)為內(nèi)羅病毒屬的Gc也是II型病毒囊膜蛋白 ， 即C端在膜內(nèi)的單次跨膜蛋白 。

研究發(fā)現(xiàn) ， CCHFV感染者血清中抗體的缺失與病人的感染致死率密切相關(guān) ， 提示抗體在保護(hù)感染者免于死亡中發(fā)揮作用 。 但目前僅有鼠源抗體發(fā)表 ， 分別靶向CCHFV的Gc、Gn和GP38 。 而根據(jù)近期在其它烈性病毒 ， 如埃博拉病毒中的研究 ， 康復(fù)患者血中可以分離到具備治療效果的中和抗體 ， 甚至在感染后出現(xiàn)癥狀時(shí)再使用依然有效 。


克里米亞-剛果出血熱病毒幸存者體內(nèi)分離出人源保護(hù)性中和抗體
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延續(xù)這種策略 ， 2021年6月1日 ， 美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的Kartik Chandran教授課題組聯(lián)合Adimab、Mapp公司及美國陸軍傳染病研究所的合作者在Cell雜志發(fā)表了題為Protective neutralizing antibodies from human survivors of Crimean-Congo hemorrhagic fever的研究文章 ， 首次報(bào)道在四名CCHFV感染幸存者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)361株靶向Gc和GP38的人源單克隆抗體 。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中的高效中和抗體靶向Gc上的6個(gè)保守抗原表位 ， 靶向表位不同的抗體可以通過協(xié)同作用發(fā)揮預(yù)防效果 。 進(jìn)一步將其中的高效抗體改造為雙特異性抗體 ， 獲得了一株可以有效保護(hù)小鼠免受致死劑量CCHFV攻毒的抗體 。


克里米亞-剛果出血熱病毒幸存者體內(nèi)分離出人源保護(hù)性中和抗體
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【克里米亞-剛果出血熱病毒幸存者體內(nèi)分離出人源保護(hù)性中和抗體】作者首先構(gòu)建了重組蛋白rGn/Gc作為誘餌 ， 在四位CCHFV康復(fù)患者的血樣中進(jìn)行單個(gè)記憶B細(xì)胞的流式分選 ， 經(jīng)過測序 ， 在酵母工程菌株中進(jìn)行單抗的異源表達(dá) ， 最終得到361株抗體 。 而后 ， 研究者使用生物膜干涉檢測了全部抗體對(duì)rGn/Gc和Gc的結(jié)合能力 ， 發(fā)現(xiàn)超過80%的抗體均可結(jié)合兩種抗原 ， 另有部分抗體特異性結(jié)合GP38 ， 但全部抗體均不結(jié)合Gn 。 進(jìn)一步地 ， 檢測這些抗體對(duì)三種分支（Clade III、I、V）來源的rGn/Gc的交叉結(jié)合能力 ， 發(fā)現(xiàn)絕大部分的Gc特異性抗體均可同時(shí)結(jié)合三種分支來源的抗原 ， 另有7株GP38特異性的單抗也存在交叉反應(yīng) 。

接下來 ， 作者通過比較全部抗體與7個(gè)靶向Gc不同表位的Fab片段的競爭實(shí)驗(yàn) ， 確認(rèn)大部分抗體均靶向六種表位中的一種 。 為確認(rèn)抗體靶向的具體表位序列 ， 作者對(duì)上述已進(jìn)行表位分類的抗體進(jìn)行表位定位實(shí)驗(yàn)：使用表面表達(dá)有Gc突變體的酵母文庫 ， 進(jìn)行三輪熒光激活的流式分選 ， 通過對(duì)Gc突變體的測序 ， 最終確定了6組表位的具體序列信息 ， 并將這些表位信息 ， 在Gc結(jié)構(gòu)模擬圖上進(jìn)行了定位（圖1） 。

克里米亞-剛果出血熱病毒幸存者體內(nèi)分離出人源保護(hù)性中和抗體
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圖1 抗體的六組表位序列及其在Gc結(jié)構(gòu)模型上的定位

為確定篩選出的單抗的中和效果 ， 作者構(gòu)建了包含全部結(jié)構(gòu)蛋白及Nano-Glo熒光素酶報(bào)告基因的病毒樣顆粒tecVLP ， 可以模擬真實(shí)病毒的入侵 ， 用于對(duì)小分子和單抗的評(píng)估 。 以恒定的抗體濃度（35 nM） ， 檢測全部抗體對(duì)分支IV阿曼毒株tecVLP的中和效果 ， 發(fā)現(xiàn)靶向Gc融合肽和結(jié)構(gòu)域II的抗體顯示最強(qiáng)的中和活性 ， 而全部GP38特異性單抗均不具備中和活性 。 作者還進(jìn)一步測試了活性較強(qiáng)抗體的廣譜中和能力 ， 確定三株抗體ADI-37801 （表位1 ， 靶向融合肽）、ADI-36121 （表位3 ， 靶向結(jié)構(gòu)域 II）和ADI-36145 （表位6 ， 靶向結(jié)構(gòu)域III）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2） 。

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